哺乳动物细胞系冷冻保存视频实验方案

冷冻保存是一种使细胞在冷冻数月或数年,并在解冻后仍保持其活力的方法。细胞冷冻保存可尽可能减少遗传变化并避免污染造成的损失。最好在细胞处于其最佳生长速率时将其冷冻保存。


甘油打印本实验方案

材料和试剂

  • 冷冻培养基
  • CoolCell® 快速冷冻机 (BioCision)

  • 冷冻培养基

冷冻保存

  1. 在冷冻管上标记好日期、研究者姓名、细胞数、细胞传代数和细胞类型(以及任何其他有用信息,比如遗传修饰)。

  2. 如果细胞贴壁,则去除细胞培养基,用 PBS 洗涤,加入足量胰蛋白酶覆盖细胞并在 37°C 培养箱中孵育约 2 分钟。在细胞培养基中重悬细胞并移入 50 mL Falcon 管中。

  3. 如果细胞为悬浮状态,只需将所需体积细胞直接移入 50 mL Falcon 管中。

  4. 用血细胞计数器进行细胞计数以确定其活力。用于冷冻保存的细胞活力至少应为 75%。

  5. 在室温下以 1,000 rpm 离心 5 分钟。

  6. 准备冷冻培养基(表 1)。



    请注意,DMSO 并不适合所有的细胞类型,因此甘油可作为替代使用。



  7. 去除上清液(上清液需要保留用于冷冻培养基,见表 1),轻轻散开沉淀物。

  8. 添加冷冻培养基至所需的细胞密度。对于哺乳动物细胞,所需细胞密度通常为 1,000,000/mL 冷冻培养基。在室温下,细胞不应在冷冻培养基中超过 10 分钟。

  9. 在各冷冻管中各分装 1 mL,并盖紧盖子。

  10. 室温下将冷冻管移至 CoolCell 快速冷冻机中,然后放入 -80°C 冰箱中。CoolCell 快速冷冻机将确保温度以 1°C/分钟稳步下降。

  11. 大约 24 小时后,从 CoolCell 快速冷冻机中取出冷冻管并转移到液氮中长期储存。


培养类型冷冻培养基注释
在含 FBS 的培养基中培养的细胞90% FBS + 10% DMSO在使用前充分混合并升温至 37°C。
在无血清培养基中培养的细胞90% 条件培养基 + 10% DMSO

使用离心步骤中的上清液(步骤 7)。

在使用前充分混合并升温至 37°C。

需要用甘油冷冻的细胞90% FBS + 10% 甘油在使用前充分混合并升温至 37°C。

1.用于哺乳动物细胞系的不同类型冷冻培养基

将冷冻细胞系解冻

  1. 从液氮储存中取出冷冻管并置于 37°C 水浴中,直至仅约 80% 解冻。这一步骤应该不超过 1 分钟。
  2. 使用移液管将冷冻管内容物转移到含有约 10 mL 预热培养基的 15 mL Falcon 管中。
  3. 以 500–1,000 rpm 离心 5 分钟,弃去上清液,在适量细胞培养基中重悬细胞。
  4. 将细胞转移到培养皿中并放入 37°C 培养箱中。


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